Il test della riboflavina è un metodo con tracciante fluorescente che serve a verificare se il fluido di lavaggio raggiunge tutte le superfici comprese nel perimetro di prova, sia sul carico sia all’interno della camera. Si applica una soluzione di riboflavina, si esegue un ciclo campione definito insieme al cliente, poi si ispeziona sotto luce ultravioletta. Ogni fluorescenza residua dopo il ciclo segnala una copertura insufficiente o non confermata in quel punto e richiede un’indagine.

Una precisazione necessaria prima di proseguire, perché il termine può risultare ambiguo. In questo contesto non ci riferiamo al dosaggio ematico della vitamina B2, né all’impiego oftalmico della riboflavina nel cross-linking corneale. Qui parliamo invece di un test industriale, in cui la riboflavina viene utilizzata esclusivamente come tracciante fluorescente, utile per visualizzare eventuali residui sotto illuminazione UV.

In sintesi

• Che cosa verifica: che il fluido di lavaggio raggiunga tutte le superfici comprese nel perimetro di prova approvato, sul carico e nella camera. Riguarda principalmente l’accessibilità e la bagnabilità delle superfici, non l’efficacia di rimozione dello sporco.
• Perimetro: Esso va valutato mediante un’analisi del rischio. Generalmente l’esito di tale analisi non si focalizza esclusivamente sul carico ma considera l’intera camera. In molti casi, infatti, è richiesto che non permangano tracce di riboflavina in nessun punto della camera, pozzetto di raccolta compreso.
• Quando si esegue: preferibilmente in collaudo di fabbrica (FAT), dove può consentire di individuare precocemente eventuali criticità di progettazione. I risultati possono supportare le successive attività di commissioning e qualifica in sito. L’eventuale ripetizione in SAT o a seguito di modifiche al carico deve essere definita dal protocollo di qualifica e/o dal change control, sulla base dell’impatto della modifica e del rischio associato.
• Tracciante: riboflavina, vitamina B2, fluorescente sotto UV e rimovibile con acqua nelle condizioni previste dalla procedura.
• Esito: visivo. Una fluorescenza residua dentro il perimetro di prova è un non conforme e apre un’indagine.
• Che cosa non sostituisce: studi di rimozione dello sporco, monitoraggio di TOC e conducibilità sul risciacquo finale, swab test, challenge microbiologico dove richiesto.

Come si chiama: test di copertura, coverage test, riboflavin test

La terminologia non è consolidata e questo può generare confusione nei capitolati.

Le espressioni che si incontrano più spesso indicano tutte la stessa prova:

• Test della riboflavina o riboflavin test, che nomina il tracciante
• Test di copertura o coverage test, che nomina l’obiettivo
• Verifica della copertura spray o spray coverage test, che nomina il meccanismo

Sono sinonimi operativi. Nei documenti di qualifica conviene però fissarne uno solo e usarlo in modo coerente all’interno del protocollo, report e SOP. In sede di audit la coerenza terminologica tra i documenti pesa più della scelta del termine.

Che cosa dimostra il test e che cosa non dimostra

La copertura è una questione di accesso: il fluido di lavaggio, nelle condizioni erogate dal ciclo di prova, ha raggiunto questa superficie?

Il lavaggio è una questione di rimozione: il residuo presente su questa superficie è stato asportato sotto un limite di accettazione definito?

Le due cose sono in sequenza, non intercambiabili. Una macchina può dimostrare la copertura e fallire comunque uno studio di rimozione, perché raggiungere una superficie non equivale a staccare ciò che vi è aderito. Il caso opposto pesa di più nella pratica: una copertura incompleta indebolisce l’evidenza che il processo di lavaggio sia robusto sull’intero carico definito, perché per le aree con accesso inadeguato non si può assumere una pulizia efficace.

Ecco perché la copertura viene prima. Avviare studi di rimozione senza avere stabilito la copertura significa rischiare di indagare la chimica del detergente quando il problema reale è un carrello che mette in ombra una faccia di uno o più parti da lavare.

Il test della riboflavina non dimostra l’efficacia di lavaggio. Fornisce evidenza che il fluido di lavaggio raggiunge le superfici incluse nel perimetro di prova. L’efficacia di lavaggio va dimostrata separatamente, con sporchi rappresentativi, limiti di residuo definiti e metodi analitici.

Il perimetro di prova comprende la camera, non solo il carico

È il punto in cui la prassi industriale diverge più spesso da come il test viene descritto, ed è anche quello che genera più deviazioni in audit.

In linea di principio è vero che l’attenzione si concentra sul carico da lavare ma sempre più è richiesto che al termine del ciclo non debba essere rilevata alcuna traccia di riboflavina in nessun punto della camera, pozzetto di raccolta dell’acqua compreso qualora l’analisi del rischio e l’uso previsto dell’apparecchiatura evidenzino tali superfici come potenziali punti di contatto, accumulo o ritenzione del prodotto e, pertanto, rilevanti ai fini della cleaning validation, in coerenza con i principi dell’Annex 15. La prova può quindi essere impostata in due modi, e nella pratica il secondo è la regola:

• Verifica di sola accessibilità. Serve ad accertare che il fluido raggiunga ogni punto del carico e della camera.
• Verifica su ciclo campione. Si esegue un ciclo completo, per accertare che l’alternanza delle fasi di risciacquo, scarico, nuovo lavaggio e scarico rimuova integralmente la riboflavina da tutte le parti a diretto contatto con il prodotto e con l’ambiente pulito di scarico.

La seconda impostazione risponde a un rischio concreto: evitare fenomeni di cross contamination al momento dell’apertura della porta. Una camera che ha lavato correttamente il carico ma trattiene residuo in un punto morto trasferisce quel residuo al carico successivo o all’ambiente classificato in cui la porta si apre.

Perché si usa proprio la riboflavina

Mostra una fluorescenza netta e ben definita sotto illuminazione ultravioletta. Il residuo di riboflavina produce un bagliore giallo verde chiaramente distinguibile sull’acciaio inox. Il segnale è discreto, non una foschia diffusa, rendendo l’ispezione visiva ripetibile e oggettiva anche tra operatori diversi.

Viene rimossa dalla sola acqua. Il test è semplice da interpretare: nelle condizioni previste dalla procedura, la riboflavina può essere rimossa con il risciacquo utilizzando solo acqua. Se l’acqua raggiunge una superficie, il residuo viene eliminato. Se invece, dopo il risciacquo, rimangono tracce di riboflavina, significa che l’acqua di lavaggio non ha raggiunto adeguatamente quella zona. In questo modo, il risultato non dipende dalla concentrazione del detergente né dal tempo di contatto.

Ha un profilo di manipolazione favorevole e un costo trascurabile. È una vitamina, usata anche come colorante alimentare E101, ed è pratica per una prova eseguita manualmente su macchine di produzione. Preparazione e impiego devono comunque seguire la procedura approvata del sito e la documentazione di sicurezza applicabile, e la compatibilità con gli elastomeri e i trattamenti superficiali effettivamente presenti va confermata sulla documentazione della macchina, non data per scontata.

Variabili e limiti che alterano il risultato

• Sensibilità alla luce. La riboflavina si degrada con l’esposizione prolungata alla luce, quindi una soluzione lasciata ferma sotto l’illuminazione dell’officina può perdere fluorescenza e produrre un falso conforme.
• Omogeneità della soluzione. Una dissoluzione incompleta o una preparazione non uniforme possono determinare una distribuzione irregolare del tracciante sulle superfici. Nelle aree in cui il tracciante si accumula, la fluorescenza sotto radiazione UV può persistere anche dopo il risciacquo, generando potenziali falsi esiti di non conformità. Al contrario, nelle zone raggiunte da quantità insufficienti di tracciante, l’assenza di fluorescenza non costituisce una prova attendibile dell’efficacia del processo, poiché potrebbe essere riconducibile a una copertura inadeguata piuttosto che a una corretta rimozione del residuo.
• Tempistiche. Gli intervalli tra applicazione, ciclo e ispezione cambiano ciò che si osserva, perché le superfici asciugano e i film residui si ridistribuiscono. Vanno fissati nel protocollo.
• Perimetro della risposta. La riboflavina non è un surrogato di residui di principio attivo, proteine o prodotto essiccato. Risponde a una domanda sola: l’acqua spruzzata dalla macchina raggiunge tutte le superfici da verificare?
• Fluorescenza intrinseca. Polimeri, adesivi, etichette e residui di detergente da cicli precedenti possono emettere fluorescenza propria. Per questo, prima del test, è necessario verificare e documentare la fluorescenza delle superfici da ispezionare, così da individuare ed escludere eventuali aree che potrebbero generare falsi positivi.

I parametri operativi variano tra le pubblicazioni di settore e tra le procedure di sito, quindi vanno presi dal protocollo approvato e non dalla letteratura. Concentrazioni nell’ordine di 0,2 g/L compaiono in pubblicazioni tecniche, altre prassi indicano soluzioni di ordine diverso, e l’ispezione si esegue con una sorgente UV specificata dalla procedura di coverage test approvata. Lunghezza d’onda di eccitazione, fluorescenza osservata e specifica della lampada sono tre grandezze distinte e non vanno confuse in un protocollo.

Nel caso di LAST Technology il riferimento metodologico non è una linea guida esterna ma una procedura interna concordata con il cliente, definita insieme in fase di pianificazione dei test. Tale approccio consente non solo di verificare il raggiungimento dei criteri di accettazione definiti, ma anche di raccogliere informazioni aggiuntive utili a caratterizzare e valutare la performance del ciclo di lavaggio, in funzione degli obiettivi specifici del test e dell’apparecchiatura.

Perché su una macchina di lavaggio non è lo stesso test di un serbatoio di processo (CIP)?

Il metodo è identico. Il problema da risolvere no. Le indicazioni di settore sulle lavatrici automatiche per componenti sono esplicite: tra i parametri da studiare e ottimizzare prima della qualifica rientrano sia la progettazione e il posizionamento del sistema di distribuzione dell’acqua, sia la configurazione di carico dei pezzi dentro la macchina. La copertura è quindi una proprietà combinata tra la macchina e il carico da processare.

La conseguenza pratica è che su una macchina di lavaggio il test di copertura non è un’attività di qualifica una tantum. È legato al carico. Una macchina che ha dato esito conforme con un carrello di flaconi non dice nulla sulla stessa macchina con un carrello di componenti di una riempitrice.

Procedura passo passo su una macchina di lavaggio farmaceutica

1. Definire la configurazione di carico worst case

Worst case non significa carico più pesante o carrello più pieno. Significa la configurazione in cui il fluido di lavaggio fa più fatica a raggiungere una superficie compresa nel perimetro di prova: di norma la combinazione tra massima densità di pezzi, geometrie più concave o cieche, e posizioni più in ombra rispetto ai punti di erogazione. Va definita per iscritto prima della prova, con una mappa di carico, perché un test di copertura su un carico non definito non produce un’evidenza ripetibile.

2. Rilevare la baseline UV prima di applicare il tracciante

Prima di procedere con il test, ispezionare la camera vuota, il carrello e il carico campione con la stessa procedura adoperata per il test. Registrare questa baseline è ciò che permette all’operatore, un’ora dopo, di distinguere una copertura incompleta reale da una proprietà del materiale. È un passaggio che quasi nessuno esegue ed è il modo più economico per evitare una deviazione infondata.

3. Preparare la soluzione e verificare il tracciante

Preparare la soluzione immediatamente prima dell’utilizzo, proteggerla dalla luce e assicurarsi che sia completamente e omogeneamente disciolta. Prima di eseguire l’intera prova, è opportuno effettuare una verifica preliminare applicando una piccola quantità su un coupon di acciaio inox pulito, oscurare l’area e confermare sotto UV che l’effetto fluorescente sia chiaramente visibile. Questa verifica richiede solo pochi minuti ed evita il rischio più insidioso del metodo: un falso risultato conforme dovuto all’impiego di un tracciante già degradato.

4. Applicare il tracciante al carico, al carrello e alla camera

Applicare un film fine e uniforme su tutte le superfici del perimetro di prova, carrello compreso e superfici interne della camera comprese. L’uniformità conta più della quantità: un ristagno abbondante su una faccia orizzontale crea una riserva che a fine ciclo sta ancora drenando e può essere letta come un non conforme inesistente.

5. Verificare sotto UV la copertura iniziale del tracciante, prima del ciclo

È il passaggio che rende l’intera prova difendibile ed è anche quello più spesso omesso. Prima di avviare qualsiasi ciclo, ispezionare il carico trattato sotto luce UV. In questa fase, tutte le superfici incluse nel perimetro della prova devono mostrare una chiara fluorescenza. Se una superficie non mostra fluorescenza, significa che il tracciante non è stato applicato in quel punto; di conseguenza, l’assenza di fluorescenza dopo il ciclo non consente di trarre alcuna conclusione. Documentare questa verifica con fotografie: è il controllo che trasforma il risultato finale in un’evidenza oggettiva.

6. Caricare la camera secondo la mappa approvata

Caricare il carrello secondo il worst case definito nel punto 1 e fotografare il carico prima di chiudere la porta. Questa fotografia documenta la configurazione effettiva della prova. È inoltre il primo elemento da verificare qualora una ripetizione produca un esito diverso.

7. Eseguire il ciclo campione definito con il cliente

Normalmente viene eseguito un ciclo di lavaggio impostato insieme al cliente, con l’alternanza di fasi di risciacquo, scarico, nuovo lavaggio e scarico. Portata, pressione, tempo, temperatura e ogni altro parametro rilevante vanno documentati perché la prova sia riproducibile.

Una scelta va concordata prima: alcuni clienti richiedono che la riboflavina sia asciutta al momento del ciclo, altri no. Quando si opta per l’applicazione a secco, di norma si attende circa un’ora dopo la spruzzatura.

8. Ispezionare sotto UV, subito e al buio

Ispezionare il carico immediatamente dopo il ciclo, in un ambiente sufficientemente oscurato da evitare interferenze della luce ambientale con l’illuminazione UV. Procedere in modo sistematico, seguendo sempre la stessa sequenza definita dalla mappa di carico, ed estendere l’ispezione alle superfici interne della camera e al pozzetto di raccolta. Per fori interni, tubi lunghi e altre geometrie difficili da raggiungere, utilizzare strumenti di ispezione adeguati, ad esempio un boroscopio con sorgente UV, qualora l’ispezione visiva diretta non sia sufficiente.

9. Registrare, indagare, correggere, ripetere

Fotografare ogni area di fluorescenza residua, in posizione, prima di toccare qualsiasi cosa. Poi indagare la causa, correggerla e ripetere la prova completa. Una ripetizione parziale sulla sola area non conforme non costituisce evidenza, perché modificare la posizione di un pezzo altera la distribuzione del fluido sui pezzi vicini.

Criterio di accettazione e perimetro di prova

Il criterio di accettazione deve essere definito prima dell’esecuzione della prova e formulato come segue: al termine della procedura di risciacquo definita, non deve essere osservabile alcuna fluorescenza residua di riboflavina su tutte le superfici incluse nel perimetro di prova approvato.

L’attenzione si concentra quindi sulla definizione del perimetro di prova. Un perimetro difendibile deve basarsi su una motivazione documentata, non su criteri di praticità. Deve comprendere le superfici a contatto con il prodotto, le superfici la cui contaminazione potrebbe migrare verso tali aree, il carrello, nonché le superfici interne della camera e il pozzetto di raccolta. Eventuali esclusioni devono essere indicate esplicitamente e supportate da una motivazione documentata, mai lasciate implicite.

Come si legge una fluorescenza residua

Una fluorescenza residua non identifica una causa. Identifica un punto su cui indagare. Trattarla come diagnosi diretta, tipicamente come ugello otturato, è l’errore di analisi più frequente in questa prova. È la configurazione di ciò che si vede a restringere il campo.

Cause tipiche di copertura incompleta e azioni correttive

La maggior parte di queste cause è legata al carico e agli accessori, più che alla macchina stessa. Per questo, il test di copertura deve essere riferito alla specifica configurazione di carico.

In tale contesto, un carrello progettato su misura è preferibile a un carrello standard adattato allo scopo: non è un semplice supporto, ma parte integrante del processo di lavaggio. Deve mantenere ogni componente nella posizione, nell’orientamento e alla distanza necessari affinché i getti d’acqua raggiungano tutte le superfici da risciacquare. Supporti, alloggiamenti e punti di fissaggio devono essere progettati per evitare schermature, sovrapposizioni, ristagni e contatti tra componenti che possano compromettere la copertura. La progettazione del carrello è quindi un’attività di qualità, da definire, documentare e verificare mediante il test di copertura.

Dove si colloca il test nella qualifica

È preferibile eseguire il test durante il collaudo in fabbrica (FAT) poiché è il momento meno oneroso per individuare eventuali criticità che possono richiedere modifiche o  la riprogettazione del carrello. I risultati ottenuti in FAT possono inoltre supportare le successive attività di commissioning e di qualifica in sito. L’eventuale ripetizione del test in sito durante il SAT o a seguito dell’introduzione di una nuova tipologia di carico deve essere definita nell’ambito del protocollo di qualifica e/o del change control, sulla base dell’impatto della modifica e del rischio associato, e non costituisce quindi un obbligo generalizzato in ogni caso.

Riboflavina e altri metodi a confronto

Documentare la prova in modo che regga in audit

Una prova eseguita senza documentazione non costituisce evidenza e non supera una revisione. Il set minimo da produrre è breve.

• Un protocollo approvato prima dell’esecuzione, che definisca configurazione di carico, perimetro di prova, parametri del tracciante, ciclo utilizzato e criterio di accettazione.
• La baseline UV pre test, con registrazione di ogni fluorescenza intrinseca osservata prima dell’applicazione del tracciante.
• Una mappa di carico con fotografie del carico sul carrello, scattate prima della chiusura della porta.
• Fotografie UV del carico trattato prima del ciclo, a dimostrare che il tracciante ha raggiunto ogni superficie sotto prova.
• Fotografie UV dell’ispezione dopo il ciclo, comprese le aree conformi e non solo le non conformità.
• Una registrazione delle deviazioni, dell’indagine, delle azioni correttive e della ripetizione completa.
• La tracciabilità del ciclo effettivamente eseguito, che dimostra in quali condizioni la copertura è stata verificata.

Quest’ultimo punto collega la prova al più ampio impianto di data integrity. Che cosa deve contenere il record di un ciclo, e come soddisfa i principi ALCOA+, è trattato nel nostro articolo su cosa deve contenere il record di un ciclo di lavaggio cGLP.

Come LAST Technology progetta le macchine di lavaggio per la copertura spray

La maggior parte delle cause di non conformità viste sopra sono esiti di progettazione, non errori di conduzione. Per questo LAST Technology tratta la copertura come un requisito ingegneristico e non come una prova da superare alla fine.

È il carico a definire la macchina, non il contrario

LAST Technology costruisce le macchine di lavaggio attorno alle parti che il cliente intende processare, dalla vetreria ai componenti di riempitrice, dai contenitori in plastica agli utensili fino ai grandi contenitori IBC. Dal punto di vista del test di copertura questo è il fattore decisivo: un carrello progettato sulla geometria reale, con l’orientamento dei pezzi vincolato dai supporti e non lasciato all’operatore, affronta alla radice le due cause di non conformità più frequenti, cioè le ombre e il posizionamento incoerente.

Carrello interno

Il carrello interno non è un semplice supporto per il carico, ma partecipa attivamente al processo di lavaggio. Gli ugelli integrati sono progettati per distribuire il fluido nelle aree schermate, nelle cavità interne e nelle geometrie che i soli ugelli della camera non raggiungerebbero in modo affidabile.

All’introduzione del carrello nella camera, il sistema si accoppia automaticamente alla rete di distribuzione del fluido della macchina. Il collegamento alimenta gli ugelli del carrello, assicurando l’erogazione del fluido nei punti previsti per il lavaggio.

Parametri di ciclo riproducibili

Un risultato di copertura vale solo per i parametri con cui è stato ottenuto. Le macchine LAST Technology eseguono ricette preimpostate e personalizzate con controllo continuo di TOC, conducibilità e pH dell’acqua di risciacquo secondo la configurazione acquistata dal cliente, e con iniezione controllata dei chimici in fase di lavaggio. Poiché il ciclo eseguito viene registrato, la verifica di copertura può essere legata alle condizioni che l’hanno prodotta.

Conclusione

Il test della riboflavina sembra banale: polvere, acqua, uno spruzzino e una lampada UV. Il suo valore sta tutto nella disciplina che gli sta intorno, cioè un carico worst case definito in anticipo, una baseline che escluda le fluorescenze intrinseche, un tracciante verificato, un controllo documentato che il tracciante abbia raggiunto ogni superficie prima del ciclo, un’ispezione che arrivi dove l’occhio non arriva e una ripetizione completa dopo ogni correzione. Tutto questo serve a rispondere a una domanda sola: il fluido di lavaggio ha davvero raggiunto ogni superficie?

Su una macchina di lavaggio quella domanda è inseparabile dal carico, ed è per questo che la copertura è un problema di progettazione prima che di validazione. Geometria del carrello, orientamento dei pezzi, disposizione degli ugelli e parametri di ciclo determinano l’esito della prova molto prima che la prova venga eseguita. Progettarli insieme, intorno ai pezzi che verranno realmente trattati, è ciò che significa personalizzazione nella pratica ed è il modo in cui LAST Technology specifica le proprie macchine di lavaggio. Per valutare la copertura sui vostri pezzi e sulle vostre geometrie, guardate le nostre macchine di lavaggio per vetrerie/ componenti cGMP serie UCW, oppure contattate il nostro reparto tecnico.

Fonti e approfondimenti

● ISPE, Pharmaceutical Engineering, “Master Soil Selection for Cleaning Validation of Parts Washers”, maggio-giugno 2021.

● ISPE, Sterile Products Processing Community of Practice, “Validation of an Automated Parts Washer”.

● ISPE, Sterile Products Processing Community of Practice, “Validation of an Automated Glassware Washer”.

● VDMA, scheda informativa sul test della riboflavina per tecnologie di processo a bassa carica microbica e sterili.

Massimo Castellarin President & CEO